三维成像为理解复杂的生物和生物医学系统提供了深刻见解，它提供的信息远比传统的二维方法详细。该领域的佼佼者是非线性光学显微镜，特别是相干拉曼散射 (CRS) 显微镜(例如相干反斯托克斯拉曼散射 (CARS) 和受激拉曼散射 (SRS) 显微镜)。CRS 显微镜利用样品中固有的生物分子振动来创建图像，为研究细胞和组织的复杂结构和分子组成打开了一扇新窗口，无需添加任何荧光标记，在分子水平上揭示活细胞和组织中细胞内和细胞外分子的动态和功能机制以及代谢活动。
CARS显微镜是最早被开发出来的，但它面临着诸如拉曼光谱扭曲和非共振背景干扰导致的灵敏度问题等挑战。SRS显微镜克服了这些障碍，通过避免非共振背景干扰，实现了高灵敏度、定量的生化成像。近年来，SRS被广泛应用于癌症诊断和表征、肿瘤代谢、药物输送和药效学、分子遗传学、器官功能和发育生物学等各个领域。在SRS中，两束激光(泵浦和斯托克斯)在空间和时间上组合并聚焦到样品上。当它们的频率差与目标分子的振动相匹配时，就会沿相位匹配方向发生相干拉曼散射过程，使SRS成像具有生物分子对比度。
本文作者开发了一种先进的 SRS 3D 显微镜，称为相位控制 SRS (PC-SRS)。这种新技术无需机械 z 扫描即可实现快速、深层组织 3D 化学成像。PC-SRS 采用独特的成像系统设计，结合了环形泵浦光束和高斯斯托克斯光束(图 1a)，并在图 1(bd)中加入了泽尔尼克多项式 (ZP)。这些设计可以精确设计贝塞尔光束的长度，并校正两束光束中的成像系统像差。在压缩贝塞尔光束的长度并校正每束光束的畸变后，PC-SRS 具有高信噪比 (SNR)。通过以电子方式调整空间光调制器 (SLM) 上的相位模式，它们可以控制组织内光束的轴向位置，即使在厚样本中也能实现 3D 成像(图 1e-g)。
PC-SRS 在成像速度和深度方面表现出显著的改进。例如，它可以在高速下(77 毫秒间隔，13 Hz 体积速率)监测聚合物珠在水中的布朗运动，并且它在脑组织等高度散射介质中提供更深的成像能力。使用抗散射贝塞尔泵浦光束和更长波长的斯托克斯光束(NIR-II 窗口中为 1041 nm)，PC-SRS 实现了与传统 SRS 技术相比大约两倍的成像深度。此外，作者使用 PC-SRS 研究活体斑马鱼肝肿瘤的代谢活动。通过追踪细胞代谢活动过程中合成的大分子中 C-D 键的形成，他们观察到肿瘤组织的代谢活动高于正常组织。PC-SRS 的快速深度分辨成像能力使他们能够揭示代谢活动在不同组织深度如何变化，即与肝肿瘤的较深区域相比，在较浅的肝脏区域观察到高度活跃的代谢。
作者认为PC-SRS对于活细胞和组织的实时监测具有巨大的潜力，有助于将对活细胞和组织中代谢和动态过程的理解转化为癌症研究、药物输送和发育生物学等领域。